甜叶菊中甜菊糖苷含量检测技术研究进展

浏览次数: 日期:2016年2月22日 11:26

一、化学发光

化学发光法是通过测定化学反应中所发出的光的强度对物质进行检测及定量的方法。化学发光法以报道用于甜菊糖苷的含量检测。杨丹等[1]利用Fe(CN)63-可以在碱性介质中可以氧化甜菊糖苷,从而产生强化学光这一原理测定甜菊糖苷含量。作者根据不同氧化剂、不同Fe(CN)63-浓度、不同NaOH浓度、不同表面活性剂、以及不同流速对结果的影响,确定了测定甜叶菊粗提物中甜菊糖苷的最佳条件,即:选择碱性的Fe(CN)63-作为氧化剂,浓度为5×10-4mol/L时(此浓度发光强度最大),NaOH浓度为0.5mol/L,主动泵和副动泵的转数为45r/min。

二、柱层析

柱层析在化学界一直是一个不可或缺的工具,其中的优势之一是:它可以改变固定性的表面化学从而调整选择性。这尤其适用于液相色谱。高效液相色谱是由经典液相色谱法发展而来的一种新型液相色谱,它由原来的常压输送改为高压输送流动相,并且利用小颗粒或者特殊处理的柱填料替代原有的多孔填充物,从而提高了分离效果[2]。色谱柱作为分离的核心部件,是将色谱填料填充到色谱柱管而得到的,它可分为正相柱和反相柱。

最近,除反相色谱和离子交换色谱以外的另一种分离模式逐渐成为研究热点:亲水相互作用色谱(HILIC)。它采用强极性固定相,结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相,使得亲水性溶质通过与极性官能团的相互作用,从而在硅胶表面保留一层亲水层,提高极性保留。HILIC是Alpert于1990年从标准的正相色谱中分离出来,成为一个术语,它主要用于反相色谱无保留的强极性化合物的分离。例如,合成和天然多肽的分离分析、糖及糖缀合物、糖肽、磷酸多肽、磷脂、寡核苷酸以及膜蛋白等生物分子的分离。Woelwer-Rieck UrSula等[3]用HILIC色谱柱,测定了甜叶菊中的stevioside和Rebaudioside A。甜叶菊经过水提后,用固相微萃取(SPE)纯化,用HILIC和氨基柱进行分离,对比了两者的分析效果,最后选定HILIC柱作为分析柱。分析条件为:色谱柱为Luna-HILIC(250×4.6 mm,59m,Phenomenex,Aschaffenburg,Germany),流动相V乙腈:V水=75:25,柱温35℃,流速1.5mL/min。

三、超高压液相色谱

利用超高压液相色谱(UHPLC)作为全面二维系统的第二维的方法,从而分析甜叶菊提取物。作者利用polyamine柱(硅胶键合多胺作为固定相)作为第一维,分离甜叶菊提取物,然后利用反相C18柱作为UHPLC的柱子,进行二维分离。Sub-2um柱(2.1mm×30 mm,70。C保存)使得分离可以在20s内完成[4]。

四、核磁共振波谱

核磁共振波谱法(NMR),是利用波长为10~100m(电磁波波长较长,能量较低;频率相当于MHz数量级)的电磁波照射样品以获得分子原子核(包括氢原子和碳原子)的相关化学结构信息。核磁共振波谱法可以提供有关分子构型、结构与运动等多种信息。Valerio Pieri等利用1H NMR来定性并定量纯化的甜菊糖苷。样品可以是纯化的提取物,也可以是纯化过程中的产物。作者利用2D NMR技术鉴定,利用1H NMR定量(葸作为内标物)。氘代吡啶:氘二甲基亚砜=6:1作为溶剂溶解样品,并且溶剂能够很好的得到完整的信号峰。检测结果与食品添加剂联合专家委员会(JECFA)所公布的HPLC-UV方法比较得到的结果非常相近,而且NMR法不依赖标准品,并且比HPLC-UV更加快速。由此可以看出NMR可以替代高效液相色谱法用于甜叶菊提取物的质量监控[5]。

五、近红外光谱法

近红外(near infrared,NIR)谱区,是波长范围在0.8~2.5um的电磁波(波数范围12500~4000cm-1)。原理是一些能量较低的电子跃迁以及分子振动状态问的跃迁所产生近红外谱区的吸收。利用近红外光谱技术分析,可以不添加化学试剂,而直接对不透明的样品进行分析,如固体状、颗粒状、粉末状和糊状样品。陈雪英[6]利用利用近红外光谱法定量测定甜叶菊中的甜菊糖苷。作者通过对不同浓度、不同批次的甜菊糖苷水溶液采集透射光谱,从而根据不同样品选取了相应的光谱范围。作者通过PLs(偏最小二乘法)对甜叶菊样品中的甜菊糖苷含量建模分析,最后建立了预测甜叶菊水溶液中各成分含量的模型,且R2>0.92。Congmin等借用HPLC方法,建立了NIR模型,用于直接测定甜叶菊中的stevioside和rebaudioside A的含量。作者从山东、安徽、江苏等地选取了72株甜叶菊,并根据这些样品的红外光谱,选定了光谱采集范围4035~6934cm-1。利用其中一个样品来建立模型。将得到的模型应用于含量测定,得到的结果与HPLC测定的结果进行比较,显示stevioside有55~4.04%的差异,rebaudiosideA有1.47-3.30%的差异。

六、毛细管电泳

毛细管电泳是在高电场强度作用下,在内径为50~100um毛细管中的被测物质,可根据分子电荷、质量、泳动度(亦称“淌度”)等性质的差异得到有效的分离。邵寒娟等利用此法,分离测定了甜叶菊中的甜菊糖苷。作者采用DMF(二甲基甲酰胺)溶解样品,用Tris一硼砂缓冲液作为分离甜菊糖苷的体系,并且对不同缓冲液浓度、缓冲液pH、工作电压、柱温、进样量等条件进行优化,最后确定了检测方案:Tris.硼砂浓度为50mmol/L,pH为8.5,工作电压为25kV,柱温为30℃,进样量为3 psi×s[7]。

参考文献

[1]. 杨丹与郝再彬, 流动注射化学发光法测定甜叶菊糖苷. 化学工程师, 2005. 19(4): 第23-24,41页.

[2]. 范云场等, 离子液体液-液萃取-高效液相色谱测定水中酚类化合物. 分析化学, 2008. 36(9): 第1157-1161页.

[3]. Wbelwer-RieckU,Lankes C,Wawrzun A,et a1.Improved HPLC method for the eva luationof themajor steviolgly cosides in 1eaves of Stevia rebaudiana『J1.Euro.Food Res.Techn01.,2010,231f4):581—588.

[4]. Francesco C,Pierluigi D,Karolina J,et a1.,Employing ultra—high pressure liquidchromatographyas the second dimension in acomprehensive two—dimensional system for analysisof Stevia rebaudianaextracts『J1.J.Chromatogr.A,2011(1218):2012—20l8.

[5]. Pieri V,Belancic A,Moralesand S,et a1.Identification andQuantificationofMajor Steviol Glycosidesin Stevia rebaudiana Purified Extracts by 1H NMRSpectroscopy『J1.J.Agr.Food Chem,201 1,59:4378-4384.

[6]. 陈雪英,李页瑞,陈勇,等.近红外光谱法定量测定甜菊糖苷的研究[J].中国食品学报,2009,9(5):195—199.

[7]. 邵寒娟,胡涌刚,丁亮,等.毛细管电泳有效分离测定甜菊糖苷新方法的研究[J].分析科学学报,2001,17(2):127.130.

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